从事重组表达的人对于密码子优化问题并不陌生，主要利用原理是不同的物种编码某氨基酸所使用的密码子偏好性不同，主要原因是不同物种内氨基酸对应的tRNA丰度不同，这个只是主要原因，其实原因并非那么简单；所以如果我们在进行密码子优化的时候仅仅粗暴地把密码子同义替换为该物种密码子对应tRNA浓度最高的那个密码子，往往起不到最佳效果，有可能还适得其反。
进行密码子优化的本意是消除稀有密码子，这里所谓的稀有密码子概念是针对某个具体的物种而言，大肠杆菌的稀有的密码子对于哺乳动物来说可能是友好的密码子。连续两个以上的稀有密码子在一起，很可能造成翻译效率急剧下降、暂停甚至翻译终止。我们在消除稀有密码子的时候还必须考虑调整GC含量、酶切位点和mRNA的稳定性等，即使考虑到以上要点，但是对于很多异源性仍然表达量很低，有的甚至比未优化之前效率更低。主要原因是忽略了翻译动力学、翻译后折叠和代谢水平等因素，蛋白质表达是一个系统工程，密码子优化并非易事。
随着研究的不断进展，文献报道了密码子协调性和密码子敏感性也制约着密码子优化对重组蛋白表达及其品质的提升。
密码子协调性是要求我们在密码子优化的时候着力于：1）用宿主中最相似频率的同义密码子替换原序列密码子；2）根据宿主密码子频率随机同义替换原基因密码子。蛋白质在机体内表达速率决定了它的活性，在源物种内选用什么频率的密码子是长期自然选择的结果，任何改变密码子频率可能影响其翻译速度，这样往往造成不正确的折叠，目前已经有很多文献报道支持此结论。在传统的策略中为了得到更多可溶性表达蛋白或者活性蛋白，我们会想办法降低其表达速度，原核表达常用的办法有：1）低温诱导：低温诱导降低其生长速度，自然其代谢和蛋白翻译降速，有时间让其正确折叠；
至于密码子的敏感性是指tRNA对其相应转运氨基酸的结合能力，结合能力越强敏感性越高，反之则反；敏感性较高的密码子对于培养液中的氨基酸浓度变化反应较大，所需氨基酸浓度变换严重影响其表达量，缓冲能力较差，这个时候换一个灵敏度较弱的密码子可以有效期到缓冲左右，明显提高产量，这些理论不是笔者胡诌乱扯，是有文献支持的，有兴趣的可以查阅文献。
所以小结一下：所以做密码子优化需要注意：1）GC含量调整；2）避免碱基重复；3）避开某些限制酶识别位点；4）Chi-site延伸重组热点；5）SD核糖体结合位点序列；6）CpG含量（真核中影响转录启动）；7）TATA box(真核中影响转录启动)；8）mRNA二级结构；9)串联稀有密码子;10)密码子重复;11)起始密码子的环境;12)核糖核酸酶E影响mRNA结构稳定性;13)真核表达中的PolyA结构可能干扰提前终止;14)其他未知的可能影响转录和翻译的影响因素
网络上关于密码子优化软件和在线工具比较多，究竟该如何抉择呢？生物实验没有一招鲜，所以实践是检验真理唯一标准，网络工具仅供参考；所谓兼听则明，可以同时用几个密码子优化工具，同时做对比测试，当然这样成本会比较高，就是看您是选择成本优先还是时间优先原则了。
我们之前有一篇利用商业公司网站进行密码子优化的（http://www.friendbio.com/meansMore/id/69），步骤有点繁琐为了大家科研工作方便，我们将一款比较简单的密码子优化工具jcat翻译成中文供大家使用。
地址链接是：www.friendbio.com/codon.html
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